以中和抗體抑制腫瘤成長因子β 可避免因放射治療引起的腫瘤加速轉移

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期刊：
臨床研究期刊 (The Journal of Clinical Investigation)  Volume 117  Number 5  May 2007


標題：
以中和抗體抑制腫瘤成長因子β 可避免因放射治療引起的腫瘤加速轉移
(Inhibition of TGF-β with neutralizing antibodies prevents radiation-induced acceleration of metastatic cancer progression)


作者
Swati Biswas,1 Marta Guix,2 Cammie Rinehart,2 Teresa C. Dugger,2 Anna Chytil,1
Harold L. Moses,1,3,4 Michael L. Freeman,5 and Carlos L. Arteaga1,2,4


單位
屬於美國田納西州 那什維爾 范德堡大學(Vanderbilt University)
1.癌症生物學系、2.醫學系、3.病理學系、4. Vanderbilt-Ingram癌症中心乳癌研究計畫 以及 5.放射腫瘤學系




摘要



我們探究了因癌症治療而產生的TGF-β究竟會不會加速腫瘤的發生。我們使用了MMTV/PyVmT
此一轉移型乳癌基因的轉殖模型，指出了游離輻射（譯註1）或doxorubicin（譯註2）都會增加循環中TGF-β1與腫瘤細胞的量，並會增加肺部的癌症轉移。這些效應都因為我們使用了泛TGF-β抗體而受抵銷。我們在有TGF-β抗體的環境下，體外培養了這些在循環中會表現多瘤病毒中等T抗原（譯註3）的腫瘤細胞，發現它們不會生長；這表示TGF-β在這些細胞中是一種生存的訊號。當老鼠的腫瘤不含有第二型TGF-β受器時，放射線就不會增加肺部的癌症轉移；這顯示至少在部分上，肺癌轉移是跟TGF-β在腫瘤細胞上的直接作用有關的。這些數據含示，癌症治療所產生的TGF-β是一種幫助癌症轉移的訊號，也提供了一個原理根據，讓我們得在癌症治療時同時使用TGF-β抑制劑。




譯註1：此為放射性治療。
譯註2：此為一癌症化學治療常用藥物，俗稱「小紅莓」。
譯註3：此為感染此病毒之初期的產生的三種T抗原中其中一種。






介紹



腫瘤成長因子TGF-β，既是一個腫瘤抑制基因，也是一個腫瘤啟動子。當TGF-β配體(ligands)結合到與其對應的絲胺酸/酥胺酸(Ser/Thr)激酶跨胞膜受器後，這些受器接著就會磷酸化、活化Smad族的訊息傳遞者。被活化之後，Smad 2、Smad 3 會與 Smad 4 結合並遷移至細胞核內，在此處調控與細胞週期停止(cell cycle arrest)、細胞凋亡(apoptosis)相關的基因之轉錄。TGF-β之所以有腫瘤抑制基因之用，即係此項調控之功。的確，在內皮細胞與基質中的TGF-β訊息傳遞，若是喪失或減弱，都會讓內皮細胞的細胞惡性轉化(transformation)大行其道。另一方面，已有研究顯示，若將顯性且無效的TGF-β受器引入至移轉的癌症細胞中，從上皮細胞型態轉變成間葉細胞型態的轉分化(epithelial-to-mesenchymal  transdifferentiation)、能動性(motility)、侵略性(invasiveness)、以及存活率(survival)均會受到抑制。這證明在已經完全轉化的細胞中，TGF-β扮演了一個腫瘤啟動子的角色（於參考文獻4中有回顧）。大部分的癌都保有TGF-β受器，卻喪失或部分喪失了Smad依賴性的抗細胞分裂效應(Smad-dependent antimitogenic effect)；同時，在某些個案中，他們還會對TGF-β有所反應，而獲得了幫助癌症轉移的能力。進而，不論癌症細胞過度生產TGF-β、過度活化TGF-β，或是兩者兼備，都會藉由旁泌(paracrine)的方式，改變腫瘤周圍的微小環境(microenvironment)，幫助腫瘤的發生。這些資料提供了支持根據，讓我們得以設法阻斷人類癌症中的自泌性(autocrine)或旁泌性(paracrine)之TGF-β訊息傳遞，以達治療之目的。



除Smad族的蛋白質外，TGF-β還可以刺激數種轉化的訊息傳遞路徑。之前TGF-β已被證實可保護轉化細胞(transformed cells)不受細胞凋亡之害。此類細胞反應有一種可能的機制，就是TGF-β誘發了PI3K和PI3K的標的物，也就是絲胺酸/酥胺酸激酶 Akt，此訊息傳遞程序和對於癌症藥物的抗藥性是相關連的。有些對傳統化學療法有抗藥性的腫瘤會過度表現TGF-β，而TGF-β的抑制劑經證明可逆轉此種抗藥性。還有，大部分的腫瘤都會過度表現TGF-β配體(ligands)。在腫瘤組織與在血清中的高量TGF-β配體，與腫瘤轉移的復發、患者較差的癒後，均有所相關。



在乳癌的基因轉殖模型中，TGF-β之訊息傳遞可加強轉移既存的乳腺腫瘤。這是受例如Neu/ErbB2或多腺瘤病毒中央Ｔ抗原(polyomavirus middle T antigen,PyVmT)等的癌症基因之誘發所致。再者，在MMTV/LTR乳腺啟動子的控制下，表現PyVmT癌症基因的基因轉殖鼠，經過有條件的TGF-β1誘導，只要兩個禮拜之短，轉移肺癌的機率便高了十倍。有些癌症治療已被證實會全面性地、或留在原處誘發TGF-β。所以我們推測，被癌症治療所誘發的TGF-β，會提供存活訊息給這些對化療有抗藥性的腫瘤裡的細胞，或者一部分此種腫瘤中的細胞，使它們可能在治療之後，立即加速腫瘤的擴展。在此，我們使用了乳癌轉移的MMTV/PyVmT 基因轉殖模型來展示，游離輻射(ionizing radiation)和小紅莓(doxorubicin)提高了循環中的TGF-β1濃度、循環中的腫瘤細胞數、以及肺部的癌症轉移。這些效應都藉由TGF-β中和抗體的施加，而得以抵銷。在缺乏第二型TGF-β受器(TβRII)的老鼠身上，放射線則沒有增加肺部的癌症轉移。這些資料暗示，癌症治療所產生的TGF-β是腫瘤中一個幫助癌症轉移的訊號，因此也提供了原理根據，使我們在使用這些療法時，得以同時搭配使用TGF-β的抑制劑。




結果



胸腔放射線處理與化學治療提高了循環中的TGF-β量。我們在八週大的未交配母鼠之胸腔與骨盆內，施加了10 Gy的放射線。在施加放射線之後隔24小時，進行血液採集。我們在受放射處理之老鼠的血漿裡，觀察到約為控制組2倍的TGF-β1含量 （胸腔，P=0.03；骨盆，P=0.02；圖一A）；同時，TGF-β2的量沒有改變（資料未呈現）。在八週大的MMTV/PyVmT基因轉殖鼠中，或是在種下MMTV/PyVmT腫瘤細胞、穩定地轉染了luciferase 表現載體的非基因轉殖鼠中，我們都得到類似的結果（分別為P=0.015與P=0.007，相較於控制組，圖一B）。在經過放射處理後，TGF-β1的濃度有持續七天比控制組高（資料未呈現）。為了將這些結果推廣到其他的癌症治療法，我們測試了DNA嵌入劑(DNA-intercalating agent)與topoisomerase II之抑制劑 doxorubicin（Adriamycin）的效果如何。從第八週開始，基因轉殖鼠被施行三次腹腔注射doxorubicin (5 mg/kg i.p.)，每次分別間隔21天。在第十五週收集到的血漿裡發現，相較於未處理的老鼠，TGF-β1濃度提高了兩倍(P = 0.009；圖一C)，而TGF-β2濃度則是持平不變。為了要測量在放射處理後五週所取得的肺臟組織中，被活化的TGF-β1之濃度，我們使用了一種TGF-β1生物檢驗來檢測，這檢測是使用一種會穩定表現plasminogen activator inhibitor-1/luciferase reporter (PAI-1/luciferase reporter) 的貂肺內皮細胞來運作的。相較於未受放射處理之老鼠肺組織裂解液，經過放射線處理的老鼠肺組織裂解液，誘導提升了有2倍多的TGF-β1濃度（P=0.0008；圖一D）。

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胸腔的放射線處理及化學治療，會增加循環中的腫瘤細胞量與增加肺部癌症轉移。TGF-β增強了會表現PyVmT腫瘤基因之腫瘤細胞的存活率，而且之前已被證實，TGF-β有條件地被誘發後，會在MMTV/PyVmT基因轉殖鼠中加速乳腺腫瘤的轉移。因此，我們推測，因治療而提升的循環中TGF-β1濃度，可能和這個乳癌轉移模型中的循環中腫瘤細胞增加、肺部癌症轉移增加，有所關連。帶有腫瘤的MMTV/PyVmT老鼠在第八週大時，被施行胸腔放射處理(thoracic irradiation)(10 Gy)直至第十三週為止。實驗終結時進行心臟穿刺以取得血液，而血液中的細胞部分，則拿去測試其在活體外生成細胞集落之能力。從未經放射處理之老鼠所取得之血液，產生了平均1.6 ± 1.5個細胞集落；而從經過放射處理之老鼠所取得之血液，於10-12天後所測量的結果是，產生了平均28.3 ± 7.6個細胞集落（P=0.02：圖二A）。PyVmT抗體的免疫染色證實，這些生長的細胞集落有表現癌症基因（圖二A）。循環中的活腫瘤細胞數有所增加；而和此相符合的是，我們在經放射處理的老鼠中，觀察到較未經處理之控制組17倍的肺部表面癌症轉移（P = 0.009；圖二B）。在被用doxorubicin處理相較於未處理之老鼠中，也在肺部癌症轉移觀察到類似的上升情形（P = 0.032；圖二C）。在施加doxorubicin 24小時之後，相較於未經處理之控制組老鼠所取得之血液，也觀察到在細胞群落數目的上升（17.2 ± 3.7與7.2 ± 2 colonies; n = 5; P = 0.007)。從老鼠的體重及一系列的腫瘤直徑數據來看，受處理與未處理的老鼠在腫瘤負荷量上並無差異，這表示TGF-β1濃度之差別，不能簡單地以腫瘤負荷量會隨時間增加來解釋。



        接下來，我們檢驗了放射線所誘發之肺部癌症轉移，是否僅限於帶有腫瘤的MMTV/PyVmT基因轉殖鼠身上。為了測試這個可能性，我們從會表現PyVmT之基因轉殖的乳腺癌中，取得表現luciferase的腫瘤細胞，然後將其注射至非基因轉殖的同源FVB老鼠身上。這些老鼠中的腫瘤，生長在左側鼠蹊(inguinal)（四號）的乳腺脂肪墊，我們以生物發光法，觀察並估計了其轉移擴散至肺臟的情形（圖三A）。當腫瘤長到了200mm3或更大時，老鼠在胸腔施加了10 Gy 的放射線並在其餘部分施加屏障，兩週後將老鼠犧牲。相較於控制組，接受放射處理的老鼠增加了三倍的表面肺部癌症轉移(P = 0.005; 圖三，B和C)。再者，在放射處理後24小時與兩週之後，分別有相較於控制組多8倍與5倍的循環中腫瘤細胞量（表一）。在實驗組與控制組間，原發腫瘤的生長率並無不同（資料未呈現）。



        將培養中的PyVmT細胞暴露在1.25 - 7.50 Gy下，會增加其產生TGF-β的量（圖四A）。在以上所述之研究過程中，有既成之腫瘤的老鼠才會施加放射線處理；循環中TGF-β濃度的增加，有可能是因為放射線在癌症細胞上的作用，因此我們想排除掉這個可能。我們對未交配的FVB母鼠施加了10 Gy的胸腔放射。在放射處理後一個小時，我們從尾部靜脈注入了表現 PyVmT 且受 luciferase 穩定轉染(stably transfected)的腫瘤細胞。肺臟中的腫瘤細胞負荷量(tumor cell burden)，是在腫瘤細胞的注入之後，使用活體內(in vivo)與活體外(ex vivo)的生物發光來監測的。經放射線處理的老鼠肺臟，表現了較控制組為高的生物發光訊號（圖四B），此訊號與人工計數之表面肺癌轉移數量是相關連的，亦與肺臟重量相關（圖四，C與D）。